I lavori di ricerca, dei quali potete leggere qui di seguito gli Abstract, sono stati presentati al Congresso nazionale SIU a Roma.
Noi consideriamo solo le prime tappe nel percorso di raggiungimento degli ambiziosi obiettivi che ci siamo prefissati.
Poster carcinoma vescicale avanzato
“Isolamento e caratterizzazione di cellule tumorali stemlike da carcinomi uroteliali a cellule di transizione (TCC)”
SCOPO DEL LAVORO
Dalla letteratura emergono conferme sempre più convincenti sull’origine dei tumori dalle cellule staminali, capaci di autorinnovarsi e di generare altri tipi cellulari differenziati.
Il fallimento delle chemioterapie correnti potrebbe essere dovuto ad un minore effetto dei farmaci proprio sulle staminali trasformate, che manterrebbero la loro potenzialità proliferativa.
Scopo di questo lavoro è stato quello di isolare e caratterizzare cellule tumorali staminali da carcinomi e cellule di transizione della vescica (TCC), un tipo di tumore tra i più diffusi e con elevata frequenza di recidive.
MATERIALI E METODI
32 campioni: 30 TURV (resezione vescicale transureterale) e 2 cistectomie. Sulle cellule isolate , e a tempi diversi di coltura, sono stati effettuati test di: citogenetica classica, ibridazione in situ fluorescente (FISH) con il kit Urovision® (per le aneuroploidie dei cromosomi 3, 7, 9 e 17); immunofluorescenza (IF) per diversi marcatori cellulari. Su fettine di tessuto paraffinato dei campioni tumorali: test di IHC e FISH con kit Urovysion®.
RISULTATI
In 22 casi su 32 il protocollo per l’isolamento ha reso possibile l’allestimento di una coltura. Dopo 48 ore in vitro sono comparse sfere in sospensione, con caratteristiche simili a quelle isolate da altri tipi di tumori.
Dopo circa una settimana di coltura sono comparse anche cellule in adesione spontanea, risultate positive in saggi di IF per: CD133 e nestina, espressi in cellule progenitrici ematopoietiche e neuronali; OCT4, espresso nelle staminali embrionali, citocheratine, marcatori specifici epiteliali.
L’IHC su fettine di tessuto tumorale ha confermato la positività per OCT4 e le citocheratine.L a citogenetica classica su preparati a fresco ha evidenziato una generale instabilità cromosomica, spesso coinvolgente il cromosoma Y mentre, dopo diversi tempi di coltura, si è notata una selezione di cellule verso ipodiploidia.
La FISH con il kit Urovysion® ha evidenziato una marcata eterogeneità per tipo di preparato, per cromosoma indagato e per isotipo che però diminuisce dopo tempi elevati di coltura.
DISCUSSIONE
Le cellule isolate secondo il protocollo applicato presentano tutti gli aspetti tipici delle cellule staminali (clonalità, autorinnovamento ecc.) e per tanto rappresentano una base di partenza importante per studi genetici e molecolari.
MESSAGGIO CONCLUSIVO
Il protocollo da noi messo a punto ci ha permesso di isolare, per la prima volta, delle cellule con caratteristiche di staminalità da carcinomi uroteliali. Analisi funzionali e molecolari atte a caratterizzare ulteriormente tali cellule, saranno utili per capire se potranno essere utilizzate a fini terapeutici.
Poster tumori renali e ricerca di base
“Identificazione di cellule renali normali e tumorali con proprietà staminali e progenitrici”
SCOPO DEL LAVORO
Un’ipotesi interessante sulla patogenesi dei tumori è quella secondo cui essi potrebbero originare da “cellule staminali tumorali” che hanno accumulato mutazioni in grado di alterarne le capacità proliferative e di autorinnovamento e che potrebbero costituire quella piccola popolazione cellulare che assicura la crescita tumorale anche dopo i trattamenti antineoplastici.
Lo scopo di questo lavoro è identificare e caratterizzare le cellule staminali del carcinoma renale (RCC) e della controparte normale al fine di identificare nuovi marcatori specifici del RCC, una neoplasia caratterizzata da una prognosi severa ed in cui solo l’intervento chirurgico nelle fasi precoci risulta essere un’efficace terapia.
MATERIALI E METODI
Per l’isolamento di cellule staminali da rene normale e carcinoma renale è stato utilizzato un approccio funzionale.
Le cellule ottenute dopo digestione del tessuto normale e neoplastico con collagenasi sono state coltivate a bassa densità in un terreno specifico serumfree DMEMF12, con l’aggiunta di B27, EGF e bFGF2, su piastre non aderenti per formare “nefrosfere” in sospensione.
E’ stata calcolata l’efficienza di formazione delle sfere (SFE) come rapporto tra il numero di sfere ottenuteed il numero di cellule piastrate. Per individuare all’interno delle “nefrosfere” la presenza di cellule quiescenti e quindi con proprietà staminali, le cellule sono state marcate prima della piastratura con un colorante fluorescente lipofilico (PKH). Sulle cellule che compongono le sfere è stata effettuata una caratterizzazione fenotipica valutando l’espressione di alcuni marcatori di staminalità ed epiteliali mediante immunofluorescenza su vetrino dopo cytospin e mediante FACS.
RISULTATI
Dopo 12 giorni dalla piastratura otteniamo “nefrosfere” primarie dal tessuto renale normale (SFE=0,5%) e tumorale (SFE=1,5%). Una volta dissociate a singole cellule e ripiastrate nelle stesse condizioni di coltura, le sfere primarie, sia normali che tumorali, sono in grado di rigenerare in 10 giorni sfere secondarie
(SFE=0,6%). Le sfere contengono una popolazione di cellule quiescenti, che mantengono il colorante PKH e quindi più intensamente fluorescenti, ed una meno intensamente fluorescente. Inoltre osserviamo cellule positive per i marcatori epiteliali Citocheratina e ECaderina, e cellule positive per i marcatori staminali CD24 (positività 90%), CD44 e CD133.
DISCUSSIONE
Le nefrosfere ottenute da tessuto renale normale e neoplastico contengono una popolazione di cellule quiescenti, quindi con proprietà staminali, ed una popolazione di cellule in attiva replicazione già “committed” verso una linea differenziativa, con proprietà di progenitori, come dimostrato dall’espressione di marcatori epiteliali e staminali nelle cellule che compongono le sfere.
MESSAGGIO CONCLUSIVO
La definizione delle differenze tra cellule staminali normali e tumorali potrà essere utile per una migliore comprensione della patogenesi del RCC e per l’individuazione di marker specifici e di nuovi target terapeutici.
Poster nuove tecnologie
“Diagnosi precoce neoplasia vescicale recidivante mediante Urovysion®”
SCOPO DEL LAVORO
La neoplasia vescicale è uno dei tumori più comunemente riscontrati nella popolazione. E’ caratterizzato da una lunga sopravvivenza associata a recidive. La diagnosi precoce delle recidive si associa ad una più bassa frequenza di neoplasia muscoloinvasiva ed a una ridotta mortalità. Il followup diagnostico necessita pertanto di elevata sensibilità. Poichè cambiamenti nel DNA delle cellule precedono generalmente i cambiamenti morfologici evidenziabili alla citologia ed alla cistoscopia, l’utilizzo di un test molecolare (Urovysion®) può evidenziare la presenza di neoplasia precocemente rispetto alle analisi convenzionali.
MATERIALI E METODI
E’ stato utilizzato il kit “Urovysion®” per la determinazione delle alterazioni numeriche dei cromosomi 3, 7, 17 e della regione 9p21 in campioni di urina processati con “thin prep”.
RISULTATI
Da settembre 2007 a marzo 2008 sono stati valutati 65 pazienti mediante citologia urinaria e FISH (Urovysion®).
Di questi, 46 pazienti (46/65 =70,8%)presentavano concordanza tra i risultati delle 2 metodiche: 13 pazienti (28,3%) avevano CTM e FISH positivo con conferma di neoplasia mediante TURV o cistoscopia, mentre in 33 (71,7%) CTM e FISH risultavano negative. Dei restanti 19 pazienti, 5 (7,8%) presentavano un campione inadeguato all’analisi molecolare per scarsità cellulare, 6 pazienti (9,2%) avevano un quadro di positività dopo indagine FISH ma CTM negativa ed 1 paziente (1,5%) mostrava FISH negativa con un quadro di displasia alla citologia urinaria. Per un ultimo gruppo di 7 pazienti (10,7%) l’indagine Urovysion® ha evidenziato cellule patologiche in un numero non sufficiente per considerare il campione positivo ed è stata pertanto catalogata come FISH sospetta.
Tutti i pazienti che rientrano in quest’ultimo gruppo presentavano citologia urinaria negativa.
DISCUSSIONE
Risulterà interessante monitorare nel tempo questi pazienti per determinare la valenza clinica del test molecolare.
Il followup nell’ultimo gruppo di soggetti potrà forse identificare una nuova classe di pazienti che necessitano di un monitoraggio più accurato e modulare l’interpretazione dell’indagine molecolare su criteri di positività intermedia.
MESSAGGIO CONCLUSIVO
Il test Urovysion® ha dimostrato utilità in aggiunta e supporto alla citologia urinaria ed identifica gruppi di pazienti che necessitano di followup diversificati.